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的IHC染色程序福尔马林固定,石蜡包埋(FFPE)组织中的概述

免疫组织化学(IHC)是一个分子测定涉及使用抗体以在显微镜载玻片上的组织内检测特定的蛋白质。   这些蛋白质被可视化用彩色色原,并用明场显微镜下观察。 IHC可以用于检测单个蛋白质的组织或抗体可以被复用,以检测在一个滑动两个或更多个蛋白。复用是查看如何蛋白在组织内一起相互作用或同时看到多个不同的细胞群的好方法。

The first and most important step in any histology procedures, including IHC, is fixation. Typically, tissues are fixed in 10% Neutral Buffered Formalin (NBF), processed and embedded in paraffin; formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissues. The length of time tissues are in fixative isn’t critical for routine H&E and special staining procedures; however, it is critical for IHC.  Formalin causes cross-linking within the proteins of tissues; these cross-links can mask the epitopes which need to be available to bind to antibodies in IHC procedures.  Over-fixation can render the tissues unusable for IHC.  Ideally, tissues for IHC should be fixed for 24-48 hours, and then transferred to 70% ethanol until processing, embedding and sectioning.

虽然组织的过度固定可导致未断裂的交联在组织蛋白质内,最佳福尔马林固定也将形成交联。这些交联可以用一个过程称为抗原(表位)检索被删除。抗原修复的两种最常用的方法包括使用热或酶。热诱导抗原活化(票数)涉及过热载玻片到90℃-125℃的温度下进行长达一个小时。票数是通过将脱蜡和水合载玻片放置在缓冲溶液中,然后将其在高压锅,微波炉或蒸锅加热完成。酶诱导抗原活化(eier)上在任室温水合组织切片或在37℃下5-30分钟下进行。

一旦检索程序完成,将组织封闭其可与染色干扰或引起的背景染色内源性组织的元素。这些内源性元件可以包括:蛋白质,抗生物素蛋白,生物素和过氧化物酶。一旦阻挡完成时,抗体被施加到组织。

下,抗体被施加到组织切片。相同的免疫球蛋白同种型作为初级抗体的不相关的对照抗体被施加到一组并行的幻灯片。例如,如果主抗体是小鼠抗CD3,同种型IgG2a的;不相关的对照抗体是小鼠IgG2a。不相关的对照抗体在相同浓度作为初级抗体施用。非特异性到测试组织的抗体的结合的同种型对照抗体对照。抗体是在载玻片上孵育在室温下,或在2-8℃过夜30-120分钟。

下一步骤是抗体检测。检测是将抗体结合到试剂将与色原体反应的步骤。检测通常与标记有HRP(辣根过氧化物酶)的聚合物的第二抗体来完成。如果初级抗体是小鼠,比检测步骤可以是山羊抗小鼠HRP聚合物。所述聚合物通常施加到滑动30-60分钟。

检测步骤之后,彩色色被添加,并且将载玻片复染。最常见的基底色是DAB(二氨基联苯胺),当由HRP催化产生褐色。因而,所关注的蛋白质或细胞上会出现滑动棕色。虽然棕色DAB是最常见的,还有其他的颜色;如紫色,粉红色/红色,蓝色,绿色和黑色。将载玻片,然后用苏木精,其染色细胞核一个浅蓝紫色复染。载玻片然后在乙醇中脱水,在二甲苯中清洗,并用树脂状的安装介质盖上盖玻片。

下面是参与IHC染色的染色步骤的总结。

染色步骤概述:

  1. 修复组织,处理,嵌入在石蜡中和部分在5μm的
  2. 脱蜡和水合水
  3. 票数eier
  4. 闭塞
  5. 初级抗体或无关抗体
  6. 发现
  7. 复染
  8. 脱水,清晰和盖玻片

HSRL的经验丰富的团队自豪地提供广泛的常规和先进的IHC染色技术FFPE组织。在多个物种中大量的抗体已证实在内部,包括小鼠,大鼠,狗,猪,非人类灵长类动物和人类。我们为所有的蛋白定位和共定位研究,提供单和多路IHC染色。

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HSRL Specializes in Histo路径ology & Specimen Storage 服务

 

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